Metodeudvikling

Kolonne- og eluentscreening

Valget af kolonne og eluent er den mest afgørende faktor for en kromatografisk metodes selektivitet og robusthed. Desværre er det ofte den faktor, der varieres og testes mindst – eller slet ikke – i en metodeudvikling.

En systematisk screening af et antal nøje udvalgte kolonne- og eluentkombinationer øger sandsynligheden for at finde den bedst præsterende konfiguration. Vi gennemfører screeningen med avanceret statistisk software og kombineret med det erfaringsbaserede valg af kolonner og eluenter opnås data til at træffe den optimale kombination af kolonne og eluent.

Parameteroptimering

Når den optimale kolonne- og eluentkombination er identificeret, er det tid til at optimere de øvrige parametre, som har mindre, men ikke ubetydelig, effekt på metodens ydeevne. For LC-metoder omfatter dette typisk valg af bølgelængde (ved absorptionsdetektion), kolonnetemperatur, flowrate og gradientbetingelser mv.

Robusthed

Robusthed kan forstås på to relevante måder i denne sammenhæng:

• Metodens evne til at producere konsistente analyseresultater trods ændringer i instrumentparametre (også kaldet ruggedness).
• Synonymt med driftstabilitet: få fejl, få nedbrud tilskrevet metoden, og bevarede valideringskarakteristika over tid, også ved kolonnevariation.

Ved kvalificering af en LC defineres acceptintervaller for specifikke indstillinger – fx kan kravet til en detektors bølgelængdenøjagtighed være +/-2 nm, og dette betyder reelt at når detektoren indstillies til 254 nm, kan den reelle detektion ske ved enhver værdi mellem 252 og 256 nm. Robusthedsstudiet dokumenterer derfor metodens evne til at fungere forudsigeligt på trods af denne variation; at analyseresultaterne ikke varierer, og at SST-kravene ikke pludseligt fejler.

Med de endelige metodeparametre fastlagt undersøges metodens ydeevne under udfordring af dens setpunkter – metoden køres med vilje ved forkerte setpunkter og det undersøges hvilken indflydelse dette har på analyseresultaterne og metodens performance.

Robusthed kan, hvis metodeudviklingen er gennemført med QbD-software, rapporteres som en rent data‑baseret øvelse baseret på eksisterende data. Det er også muligt at udføre et egentligt, uafhængigt robusthedsstudie med nye eksperimentelle data.

Robusthedsstudiet afsluttes med en rapport, der konkluderer på observerede effekter og metodens parathed til validering. Der kan desuden udarbejdes vejledende SST-krav til metoden, som fastsættes endeligt i forbindelse med valideringen.

Avanceret prøveforberedelse

Nogle analysemetoder kræver omfattende prøveforberedelse, herunder kemisk modificering af analytten/analytterne, oprensning og/eller buffer-skifte. Ethvert trin i disse processer kan påvirke det endelige analyseresultat, og myndighederne vil ofte kræve dokumentation for de valgte trin, deres setpunkter og varighed.

Tag eksempelvis en prøveforberedelse med opvarmning til 40 °C i 2 timer efterfulgt af 10 min centrifugering ved 7000 rfc. Er dette tilstrækkeligt med hensyn til temperatur, hastighed og tid? Hvad vil konsekvenserne være, hvis varmetiden reduceres til 1 time? Dette designspace bør afdækkes for at fastlægge, inden for hvilke intervaller prøveforberedelsen leverer konsistente oprensede/modificerede prøver. Dette er vigtigt både for kvaliteten af jeres analyserestultater, for myndighedsdokumentation og for at identificere og undgå overforarbejdning.